Genomredigering og fremtid

Introduksjon
Helt siden oppdagelsen av DNA har flere teknologier utviklet seg for å genetisk manipulere organismene for bedre landbruks- og industriapplikasjoner. Neste generasjons sekvenseringsteknikker har gjort identifiseringen av de forskjellige genene og mutasjonene i DNA enklere. GMOene og kloningsteknikkene som har vært i bruk i lang tid nå, er det direkte resultatet av fremskrittet på dette området. Disse kloningsteknikkene har blitt utnyttet for et bredt spekter av medisinske, landbruks-, industrielle og forskningsapplikasjoner de siste tiårene. Til tross for all utvikling og fremgang er det et konstant behov for mer avanserte genredigeringsteknikker som er presise og nøyaktige. Bruken av programmerbare nukleaser for genetiske modifikasjoner har økt det siste tiåret på grunn av potensialet til å behandle ulike arvelige sykdommer og kreft. I løpet av det siste tiåret har tre hovedklasser av programmerbare nukleaser kommet frem i lyset – sinkfingernukleasene (ZFN), transkripsjonsaktivatorlignende effektornukleaser (TALENs) og de grupperte, regelmessige, korte palindromiske repetisjonene (CRISPR) – assosiert Cas9 (CRISPR/Cas9) .

Sinkfingernukleaser (ZFN)
ZFNs var det tidligste utviklede genomredigeringsverktøyet med større presisjon for deres evne til å endre det genetiske innholdet. ZFN-ene er laget av to domener, gjentatte sinkfingerproteiner (ZFPs) med deres DNA-bindende domener fusjonert til det ikke-spesifikke DNA-spaltingsdomenet til en FokI-restriksjonsendonuklease. ZFN-er fungerer som en dimer der hver monomer enhet har en evne til å gjenkjenne ni til 18 basepar (bps) av DNA via sink-finger-DNA-bindende domene. Det er et bredt spekter av sinkfingerdomener som gjenkjenner de distinkte DNA-trillingene. Disse kan settes sammen for å generere polydactyl sink-fingerproteiner som kan målrettes mot et bredt spekter av mulige DNA-sekvenser. Imidlertid er redigering/mutasjoner utenfor målet den største bekymringen knyttet til ZFNs-basert genredigering. Derfor er det store muligheter for å forbedre effektiviteten av denne prosessen.

Transkripsjonsaktivatorlignende effektornukleaser (TALENs)
TALENs har dukket opp som et alternativ til ZFNs for genomredigering. I likhet med ZFN-ene omfatter TALEN-er to programmerbare DNA-bindende domener fusjonert til et FokI-endonukleasedomene og fungerer ved å introdusere dobbeltstrengsbruddene (DSBs). Transkripsjonsaktivatorlignende effektorer (TALEs) utskilles naturlig av Xanthomonas spp. av bakterier som binder seg til vertsorganismens DNA. TALE DNA-bindingsdomenet er flere repetisjoner med 33-35 aminosyrer hvor hver repetisjon gjenkjenner et enkelt nukleotid. Spesifisiteten i TALE DNA-bindingsdomenet skyldes tilstedeværelsen av hypervariable regioner tilstede i hvert domene ved 12 og 13 aminosyreposisjoner. Derfor kan de sekvensspesifikke TALEN-ene genereres ved å modifisere disse aminosyrerestene i hypervariable regioner og koble de forskjellige TALE-repetisjonene sammen.

Klyngede, med jevne mellomrom korte palindromiske repetisjoner (CRISPR)-assosiert Cas9 (CRISPR/Cas9)
I tillegg til ZFN-er og TALEN-er, er CRISPR/Cas9 et annet raskt voksende genredigeringsverktøy. Det er et naturlig forekommende bakteriesystem som fungerer som en komponent i bakteriell adaptiv immunitet. Det gir beskyttelse til bakterier fra invaderende virus og plasmider via RNA-veiledet DNA-spalting av Cas-protein. Det er tre hovedkomponenter i CRISPR/Cas9-systemet – CRISPR RNA (crRNA), det transaktiverende crRNA (tracrRNA) og Cas9-enzymet. CrRNA blir transkribert fra det invaderende systemet og kjent som protospacer-sekvens og hybridiserer med tracrRNA som utløser og fungerer som base for bindingen av Cas9 nuklease til stedet for DNA-spalting. I motsetning til ZFNs og TALENs-systemer som gjenkjenner de spesifikke sekvensene i den gitte genomsekvensen ved å bruke forskjellige gjenkjennelsesproteiner, bruker CRISPR/Cas-systemet RNA-sekvensen komplementær til den genomiske målsekvensen. Fordelen med RNA-hybridisering i stedsspesifikk spaltning utløser bruken av kimærisk "guide" RNA (gRNA) for den genomiske redigeringen, som skapes ved å smelte sammen crRNA og tracrRNA. gRNA inneholder 20 nukleotidguidesekvenser designet for binding til spesifikke DNA-sekvenser. Derfor er gRNA og Cas9 i stand til å skanne det aktuelle stedet og binde seg til det for å lage stedspesifikke dobbeltstrengsbrudd (DSB). Dermed tilbyr CRISPR/Cas9-systemet en relativt mer nøyaktig teknikk for genredigering sammenlignet med de tidligere teknikkene og kan brukes til et bredt spekter av applikasjoner.

konklusjonen
Så langt er det tydelig at de nåværende genredigeringsmekanismene er mer presise og har et bredt anvendelsesområde uten å ha større etiske og fysiologiske implikasjoner. Derfor er større økonomiske fordeler og kontinuerlige forbedringer på dette feltet uunngåelige. Dessuten er rasjonell forskning og utvikling, riktig målidentifikasjon og beskyttelse av intellektuell eiendom betydelig viktig for å utvikle neste generasjons terapeutiske midler, biologiske produkter og prosesser.